非洲豬瘟熒光定量PCR儀標(biāo)準(zhǔn)化操作流程

　　一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

　　1.設(shè)備預(yù)熱：

　　開啟非洲豬瘟熒光定量pcr儀，選擇預(yù)運(yùn)行程序進(jìn)行系統(tǒng)預(yù)熱，建議預(yù)熱時(shí)間≥30分鐘。檢查各溫控模塊性能，確保溫度波動(dòng)≤±0.5℃（95℃測(cè)試點(diǎn)）。

　　2.樣本處理：

　　核酸提取：采用商品化核酸提取試劑盒，按說明書操作獲取DNA模板。提取后的核酸需在2小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)，-20℃保存不得超過7日。

　　試劑準(zhǔn)備：配制反應(yīng)體系（20μL體系）：

　?。?）2×熒光PCR反應(yīng)液 10μL

　　（2）引物探針混合液 1μL

　?。?）酶混合物 0.5μL

　?。?）模板DNA 5μL（濃度50-100ng/μL）

　　（5）滅菌ddH?O 3.5μL

　　配置好的反應(yīng)體系于冰上保存?zhèn)溆?，避免反?fù)凍融。

　　二、實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程

　　1.上機(jī)設(shè)置

　　選擇ASFV專用檢測(cè)程序：

　?。?）預(yù)變性：95℃ 30s

　?。?）循環(huán)擴(kuò)增（40 cycles）：

　　①變性：95℃ 5s

　?、谕嘶?延伸：60℃ 30s

　　③熒光采集：FAM通道（探針檢測(cè)）

　　2.樣本裝載

　　將配置好的反應(yīng)管裝入加熱模塊，確認(rèn)：

　?。?）管蓋密封完好

　?。?）試管無氣泡殘留

　?。?）樣本編號(hào)與軟件對(duì)應(yīng)

　　設(shè)置陰性對(duì)照（N/C）、陽性對(duì)照（P/C）和標(biāo)準(zhǔn)品，建議每板設(shè)置3個(gè)N/C。

　　3.儀器運(yùn)行：啟動(dòng)PCR程序，實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增曲線。正常狀態(tài)下，陰性對(duì)照應(yīng)無S型擴(kuò)增，陽性對(duì)照CT值應(yīng)在18-25之間。

　　三、結(jié)果分析與報(bào)告

　　1.數(shù)據(jù)分析

　　CT值判定標(biāo)準(zhǔn)：

　?。?）CT≤30且呈現(xiàn)典型S型曲線為陽性

　　（2）CT＞35或無擴(kuò)增曲線為陰性

　?。?）30＜CT≤35需重復(fù)驗(yàn)證

　　FAM通道Ct值≤閾值（可參照試劑盒要求）判定為ASFV核酸陽性。

　　2.報(bào)告生成

　　報(bào)告內(nèi)容應(yīng)包含：

　?。?）樣本編號(hào)及來源；

　?。?）CT值及擴(kuò)增曲線圖；

　?。?）陽性/陰性判定結(jié)果；

　　（4）檢測(cè)及復(fù)核人員簽名；

　　（5）檢測(cè)日期及實(shí)驗(yàn)室信息；

　　3.廢棄處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，生物危害廢棄物需按規(guī)程處理，反應(yīng)管置于專用廢料桶中。
 

　　四、非洲豬瘟熒光定量pcr儀注意事項(xiàng)

　　1.操作全程必須穿戴防護(hù)服和手套；

　　2.每批次實(shí)驗(yàn)需同時(shí)設(shè)立陰、陽性對(duì)照；

　　3.儀器表面每日使用75%乙醇消毒；

　　4.建議每月使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行儀器校準(zhǔn)；

　　5.當(dāng)檢測(cè)結(jié)果異常時(shí)，必須進(jìn)行復(fù)檢確認(rèn)。

　　本操作流程嚴(yán)格遵循GB/T 40947-2021《非洲豬瘟診斷技術(shù)》國家標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范化的操作可有效預(yù)防交叉污染，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)室需建立完整的質(zhì)量控制體系，定期對(duì)操作人員進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，為非洲豬瘟防控工作提供科學(xué)依據(jù)。